PCR實驗代測準備工作

更新時間：2018-06-25

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　　PCR實驗代測準備工作

　　PCR實驗代測有三步：抽提RNA，RT，PCR。

　　試驗前注意：

　　1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。

　　2.RT按要求做，一般不會出太大問題。

　　3.PCR如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。

　　實驗器具的處理與準備：

　　1、塑料制品：(包括槍頭、EP管、勻漿管等)先將DEPC水從容量瓶中倒入瓷缸中，將塑料制品逐個浸泡其中，其中小槍頭需要吸管打入DEPC水，過夜，然后高壓，再烤干備用，實驗前將槍頭等放入吸頭臺，再高壓一次(EP管)。

　　2、玻璃制品：泡酸過夜，沖洗干凈，蒙錫紙烤干備用(DEPC水泡)(洗凈后先泡1‰DEPC過夜，再烤干)。

　　3、勻漿器：(包括剪刀、鑷子)先洗凈后，再高壓(不需要泡DEPC

　　試驗試劑：

　　1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml雙蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中靜置4小時備用。

　　2、75%乙醇：用無水乙醇+DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高壓)。

　　3、異丙醇：放入棕色瓶中。

　　4、lu仿：放入棕色瓶中。

　　5、瓊脂糖

　　注意事項：

　　1、逆轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵步驟是立即冰水浴。

　　2、Rt時，先打開PCR預熱30分鐘。

　　3、RNA抽提前，打開離心機預冷。

　　4、在所有RNA實驗中，關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。在實驗中，一方面要嚴格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。

　　5、做RT前必需測RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。

　　6、RT按要求做，一般不會出太大問題。

　　7、PCR，按常規(guī)。但如需擴長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。

　　8、注意避免有毒、有害試劑傷害自己和他人：lu仿、溴化乙錠(EB)、酚、異硫氰酸胍、紫外線等

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