WB實(shí)驗(yàn)代測的優(yōu)勢及操作步驟

更新時間：2020-08-19

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　　一：WB實(shí)驗(yàn)代測的優(yōu)勢：

　　下面我們就做WB實(shí)驗(yàn)代測的原理以及大致需要的操作做了一個匯總。

　　1、western免疫印跡是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。

　　2、與southern或northern雜交方法類似，但western免疫印跡采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。

　　3、經(jīng)過page分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。

　　4、以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。

　　二：WB實(shí)驗(yàn)代測的操作步驟：

　　1、蛋白質(zhì)樣品獲得：細(xì)菌誘導(dǎo)表達(dá)后，可通過電泳上樣緩沖液直接裂解細(xì)胞，真核細(xì)胞加勻漿緩沖液，機(jī)械或超聲波室溫勻漿0.5-1min。然后4℃，13,000g離心15min。取上清液作為樣品。

　　2、WesternBlot實(shí)驗(yàn)電泳：制備電泳凝膠，進(jìn)行SDS-PAGE。

　　3、WesternBlot實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)移：（半干式轉(zhuǎn)移）

　　4、電泳結(jié)束后將膠條割至合適大小，用轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡。

　　5、膜處理：預(yù)先裁好與膠條同樣大小的濾紙和NC膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液中10min。

　　6、轉(zhuǎn)膜：轉(zhuǎn)膜裝置從下至上依次按陽極碳板、標(biāo)準(zhǔn)層濾紙、NC膜、凝膠、標(biāo)準(zhǔn)層濾紙、陰極碳板的順序放好，濾紙、凝膠、NC膜準(zhǔn)確對齊，每一步去除氣泡，上壓500g重物，將碳板上多余的液體吸干。

　　7、接通電源，恒流1mA/cm2，轉(zhuǎn)移1.5hr。轉(zhuǎn)移結(jié)束后，斷開電源將膜取出，割取待測膜條做免疫印跡實(shí)驗(yàn)。將有蛋白標(biāo)準(zhǔn)的條帶染色，放入膜染色液中50s后。

　　8、在50%甲醇中多次脫色，至背景清晰，然后用雙蒸水洗，風(fēng)干夾于兩層濾紙中保存，留與顯色結(jié)果作對比。

　　總結(jié)：實(shí)驗(yàn)代測中的優(yōu)勢及操作步驟，看完本文您就應(yīng)該有了基本的認(rèn)識和了解相信大家都明白了吧！總的來說，希望對大家有所幫助。

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