實時熒光定量PCR檢測服務(wù)的用途及常見問題

更新時間：2020-12-22

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　　一、實時熒光定量PCR檢測服務(wù)的用途：

　　1、基因表達研究：對β地中海貧血癥患者β與γ珠蛋白mRNA水平進行檢測，其結(jié)果特異性強、定量準(zhǔn)確，為了解β地中海貧血的分子病理機制及其研究診斷提供了可靠的檢測數(shù)據(jù)。

　　2、轉(zhuǎn)基因研究：利用兩種發(fā)光探針及適當(dāng)?shù)难h(huán)閾值，擴增一個轉(zhuǎn)移后的基因和一個對照基因，以分析轉(zhuǎn)基因老鼠接合性。

　　3、該方法為多個轉(zhuǎn)基因動物的同型結(jié)合及異質(zhì)結(jié)合提供了明確的鑒定結(jié)果。通過實時定量PCR檢測，同型結(jié)合的異質(zhì)接合動物交配后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況符合孟德爾遺傳規(guī)律。

　　4、這項技術(shù)在轉(zhuǎn)基因動物繁育及基因劑量功能效應(yīng)實驗中將有很大的用途。

　　5、單核苷酸多態(tài)性及突變分析：實時熒光定量PCR一個誘人的應(yīng)用前景是用于檢測基于兩條探針和基因組的不穩(wěn)定性。

　　6、基因突變基于兩條探針，一條探針橫跨突變點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團標(biāo)記。

　　7、如靶序列中無突變，探針雜交便*配對，如有突變，則探針與靶序列不*配對，會降低雜交體得穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度。這樣便可對突變和多態(tài)性進行分析。

　　二、實時熒光定量PCR檢測服務(wù)的常見問題：

　　1、引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性。

　　2、模板量不足：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的濃度做起。

　　3、模板降解：避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。

　　4、擴增效率低:反應(yīng)條件不夠優(yōu)化，設(shè)計更好的引物或探針、改用三步法進行反應(yīng)、適當(dāng)降低退火溫度、增加鎂離子濃度等。

　　5、PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量不足。

　　6、PCR產(chǎn)物太長：一般采用標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)物長度。

　　7、加樣存在誤差：使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。

　　8、標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解：應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

　　9、引物或探針不佳：重新設(shè)計更好的引物和探針。

　　10、模板中存在抑制物，或模板濃度過高。

　　11、引物設(shè)計不夠優(yōu)化：應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。

　　12、引物濃度不佳：適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。

　　13、鎂離子濃度過高：適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。

　　14、模板有基因組的污染：RNA提取過程中避免基因組DNA的引入，或通過引物設(shè)計避免非特異擴增。

　　總結(jié)：實時熒光定量PCR檢測服務(wù)的用途及常見問題小編就分享到這了，看完本文您就應(yīng)該有了基本的認(rèn)識和了解相信大家都明白了吧！總的來說，希望對大家有所幫助。

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